玉米育种的方法及原理，提高玉米育种和授粉效率的实用方法
当目标植物的花丝具有可接受性时，获得足够数量的高质量花粉对玉米育种和遗传学研究的种子生产至关重要。玉米花粉一般寿命短，对极端的水分和温度敏感。如何储存花粉以供后期使用，并提高授粉过程的效率，将为植物育种和遗传学研究提供实质性的好处。
主要
观点
通过人工授粉增加种子是玉米育种和遗传学研究的重要组成部分，可促进育种计划的世代发展，创建所需的杂交，并生产用于试验的杂交种子。田间和受控环境中的授粉依赖于受体丝接受时高质量花粉的可用性。一般来说，授粉是通过在授粉前一天将雄穗上的纸质授粉袋捕获到雄穗上的花粉来进行的，然后将新释放的花粉转移到目标植物的花丝上。在田间，玉米花粉在开裂后仅能存活一到四个小时，并且干燥速度受到环境条件的影响。我们开发了一种方法，通过将新鲜花粉与可保存多天的稀释剂混合，可以延长花粉的寿命，并允许使用单个雄穗的花粉为许多植株授粉。我们确定了合适基材的特征，并选择了基于 PEEK 的材料进行常规使用。我们评估了花粉活力，并凭经验证明，当花粉与 PEEK 基质混合并在 6°C 下储存时，花粉的储存时间长达 9 天。花粉储存方法用于对 24 个测试的玉米自交系进行成功授粉，通常相当于标准的人工授粉过程。这种方法有可能提高育种操作的效率，并且可能在一系列遗传研究中有用。
core idea
育种和遗传学研究中的人工授粉需要在受体丝有活力的情况下才能获得花粉。
该方法采集并储存玉米花粉至少5天，便于高效授粉。
花粉与聚醚醚酮混合使用，使用野外采集的花粉和简单的储存条件。
该方法可以增加每穗授粉的数量，并产生合理数量的活种子。
方法
最初测试了五种潜在的贮藏基质与玉米花粉混合。这些产品包括Evonik的Aeroperl 300/30(产品代码:10024572)，Evonik的Sipernat 22 S(产品代码:99002421)，mevonik的Sipernat D 13(产品代码:10020326)，cospheres的蓝色聚乙烯(PEM)(产品线:BLPMS-1.00)，以及DicaLite管理集团的DicaLite Natural Diatomaceous Earth。2019年夏季，将每种培养基与从玉米自交系PHAJ0中收集的花粉混合，这些花粉来自威斯康星州维罗纳的西麦迪逊农业研究站的一个制种苗圃。2019年，为了评估这5种贮藏基质，采集花粉的方法是:将田间花粉前棚里生长的植物的留穗去除，并将其置于凉白色T12荧光灯下的FloraLife Crystal Clear Flower Food 300液体培养基中，以促进花药发挥。当50%的流苏脱落花粉时，将花药从流苏枝上抖落下来，放入120ml(4盎司)的无菌杯中。首先，通过不锈钢过滤器过滤花粉，去除花药和大碎片(图1b)。然后使用Tansoole实验筛再次筛出80目(0.180 mm)的花粉，以去除小块的花粉(图1c)。然后将筛过的花粉以1:5的比例分别与五种存储基质中的每一种混合，并倒入一个玻璃小瓶中。水平放置基质和花粉混合物，轻轻旋转大约5次，直到培养基和花粉均质。混合物保存在密封的120 mL (4 oz)无菌样品杯中，并储存在恒温4℃的冷藏室中(图1f)，或直接用于用易受花粉丝授粉植物(图1g)。
混合的玉米花粉被应用于亲本自交系的穗上，在丝出苗前将其覆盖，以确保胚珠能从储存的花粉中授粉，并防止邻近植株的污染。一般来说，在每一个实验中，只剪去出苗前的鲜穗组织，以促进花丝的伸长。图1g和2c,f提供了所有实验中具有代表性的授粉的例子。为了进行授粉，轻轻旋转花粉混合物三次，并将一小部分稀释到应用容器中，该容器可以是一个50毫升的猎鹰管或一个2.7盎司的玻璃容器，直径约5-10毫米。将容器中混合的花粉大约三次“摇”到植株上，其中一次摇是指当容器保持与前臂垂直时，涂抹器的手臂从90°到45°的角度移动(图1g)。根据20次重复的平均值，每个玉米穗施约0.047 g(±0.003标准误差)的花粉-底物混合物。授粉后立即在穗梢上放置一个流苏袋，并在穗对侧钉在一起，以防止邻近植株的花粉落在花丝上(图1h)。
分别于贮藏2、6和21 d后，在上午9时至11:00之间，将混合花粉分别施于两株玉米自交系LH244上。在同一天，将未稀释的PHAJ0储存的花粉施于两株LH244植株上，以接受丝为对照。涂敷后直接盖，2周后采收。在收割的时候，四个玉米穗上每一穗上的玉米粒的数量会被直观地计算出来。
另一种存储介质PEEK-MP140由PolyClean技术公司生产，于2020年夏季在WI维罗纳的West Madison农业研究站进行了现场评估。PEEKMP140是一种由回收聚醚醚酮(PEEK)， 450G制成的细磨粉末。花粉收集、储存并应用于具有接受丝的目标植物，采用与上述步骤相似的方法，只是对花粉收集方法进行了略微修改。为了评估PEEK-MP140作为储存基质的2020年至2022年，以及在我们玉米育种和遗传计划的常规利用过程中，将花粉提前24 h放置在花粉亲本的花序上收集花粉，并在植株开裂后收集新释放的花粉。带着新鲜花粉的流苏袋从植株上取下，并立即在距离采集花粉的田地两到三英尺的工作站进行筛选。花粉通过100目(0.154 mm)的金属过滤器进行筛分，在混合前除去花药和大碎屑(图1b)。将PEEK-MP140和花粉混合物水平放置，轻轻旋转约5次，直到均质(图1e)。图1给出了我们收集、储存和应用花粉的方法的工作流程，所有步骤都在支持信息S1中提供的指导手册中列出。通过将1份花粉与5份基质(1:5)和1份花粉与10份基质(1:10)的混合物储存来评估PEEK-MP140作为贮藏基质的效用，以评估花粉浓度如何影响籽粒充填。混合后的花粉被放置在一个密封的密闭容器中，然后该容器立即被运送到6℃的步入式冷藏室中长期存放.混合的花粉被放置在一个冷袋上，并在运输到冷藏室的过程中保存在一个标准的冷却器中。每天上午10时左右，用上述方法(如图1g所示)，用混合花粉为一个商业自交系的五个不同植株授粉。
描述花粉采集、储存和应用过程的流程图。(a)采集花粉前24小时，将花粉袋放置在花粉亲本的花序上，在植株新鲜花粉开裂后移除。在从花序上取下穗状袋后，花粉袋内的花粉被带到靠近田地2-3英尺的工作站，并通过(b)首先将花粉倒入金属过滤器以清除大的碎片，然后通过(c) 100目的筛网以清除聚集的花粉。(d) 1份花粉对5份(1:5)PEEK-MP140的浓度，(e)混合使用。(f)将混合的花粉直接转移到玻璃香料容器中，应用于有接受丝的植物上。在储存混合花粉时，将混合物立即置于密封的密闭容器中，运输至步入式冷藏室(4℃至6℃)长期储存。混合后的花粉在从田间运往冷藏室的过程中，被放置在一个标准冷却器中的冷袋中。(g)每穗梢施约0.047 g(±0.003)混合花粉，(h)授粉穗上覆一穗袋。(i)在混合花粉贮存达4天的情况下，用混合花粉传粉的耳朵与对照自花传粉的耳朵比较(最左边)。
本研究的目的是开发和评价一种实用的、经济有效的收集和储存玉米花粉的方法。鉴定出一种基质，PEEK-MP140，其大小接近单个花粉粒，可用于生产支持延长花粉活力的均质悬浮液。即使储存了6天，该方法有可能保持足够的可活花粉粒，这样平均每穗至少可以收获50粒玉米籽粒，而且该方法适用于多种玉米自交系(表5)。同时，玉米花粉可以保存在聚乙烯基基质中，并保存在液氮中，以备以后使用，这种方法成本高，效率低。本文所演示的方法通过使用基于peek的介质而不进行深度冻结，从而缓解了后两个问题。使用这种方法，储存的玉米花粉可以常规用于育种计划或遗传学研究的种子生产。玉米花粉的储存有利于成熟差异种质的杂交，使常规种植和杂交变得复杂。在这些情况下，可以收集、混合、储存早开花自交系的玉米花粉，并在晚开花亲本发花时施用于其丝上。种植“延迟行”，或在初次种植后的某个时间增加行，以增加同步花粉脱落和出丝的概率，是一种广泛使用的做法，但后勤工作复杂，当使用开花特征未知的新种质时，并不总是一种可行的策略。
高效的种子生产对植物育种和遗传项目至关重要，但这是劳动密集型和昂贵的。然而，通过收集花粉并将其以较低的浓度储存在适当的基质中，可以减少制种的时间和成本，因为据估计，单穗可产生100多万个花粉粒，但一个自交系的所有胚珠只需200 – 300个可活的花粉粒即可受精。在育种计划中使用储存的玉米花粉的想法从20世纪20年代早期就开始探索，但由于该过程的成本、复杂性和可重复性，其实用性有限。我们证明了一个简单和成本效益的过程，在育种计划和遗传学研究常规种子产生的实际用途。
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